2·1·2 流動(dòng)相的確定 考察了分別采用甲醇-磷酸鹽(圖1A)和甲醇-Tris緩沖液為流動(dòng)相(圖1B)時(shí)的分離效果。結(jié)果表明, 2種緩沖溶液的分離效果相當(dāng),混合芳香胺得到很好的分離。對(duì)于2, 6-二甲基苯胺和2, 4-二甲基苯胺(圖1中13、14號(hào)峰),采用磷酸鹽緩沖液的分離效果明顯優(yōu)于Tris緩沖溶液。因此本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇-磷酸鹽緩沖溶液為流動(dòng)相。
2·1·3 定容溶劑的選擇 許多芳香胺存在同分異構(gòu)體,如:鄰甲苯胺與對(duì)甲苯胺、對(duì)氯苯胺與間氯苯胺、2, 4-二甲基苯胺與2, 6二甲基苯胺、1-萘胺與2-萘胺等[18]。采用單一的GC-MS或HPLCDAD方法時(shí),對(duì)于某些同分異構(gòu)體的芳香胺不能準(zhǔn)確定性,因此經(jīng)常需要同時(shí)采用2種色譜檢測(cè)手段。在原SN/T 1045·1-2002標(biāo)準(zhǔn)中,最后一步操作須將提取的芳香胺用二氯甲烷從水相萃取后,將二氯甲烷轉(zhuǎn)移出,再氮?dú)獯蹈?甲醇溶液定容,步驟繁瑣,極易造成損失。本實(shí)驗(yàn)最后一步加入甲基叔丁醚作為定容介質(zhì),以滿足處理后的樣品在HPLC和GC -MS上同時(shí)進(jìn)樣的要求。實(shí)際在HPLC上對(duì)分別以甲基叔丁醚和甲醇為溶劑配制的芳香胺標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分離,比較發(fā)現(xiàn)甲基叔丁醚溶劑標(biāo)準(zhǔn)品中2, 4-二氨基甲苯和2, 4-二氨基苯甲醚(圖2, 1、2號(hào)峰)峰形尖銳,分離效果明顯優(yōu)于甲醇溶劑標(biāo)準(zhǔn)品,但是2, 6-二甲基苯胺和2, 4-二甲基苯胺(圖2, 13、14號(hào)峰)無法分離。其余峰的分離情況二者無顯著差異。綜合考慮, HPLC進(jìn)樣前,在進(jìn)樣瓶中將甲基叔丁醚溶劑吹干替換為甲醇溶劑。為保證氮?dú)獯蹈蛇^程中不損失或盡量減少待測(cè)物質(zhì)的損失,吹干前先加入微量1 mol/L鹽酸與待測(cè)芳香胺成鹽,吹干后再用等量1 mol/L氫氧化鈉與生成的鹽反應(yīng)將芳香胺釋放出。
2·2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化
2·2·1 提取溶劑的優(yōu)化 SN/T 1045·1-2002標(biāo)準(zhǔn)中以乙醚為提取溶劑。乙醚在使用前需要除去過氧化物并進(jìn)行重蒸餾,且乙醚的沸點(diǎn)低,在蒸餾過程中易爆。本實(shí)驗(yàn)將乙醚改為甲基叔丁醚,大大提高了實(shí)驗(yàn)的安全性,簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟,同時(shí)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,待測(cè)芳香胺的提取效率不受影響。
2·2·2 凈化試劑的優(yōu)化 將SN/T 1045·1-2002標(biāo)準(zhǔn)中凈化試劑十一鎢硅酸鉀改為十一鎢硅酸鈉。由于鈉鹽比鉀鹽的可溶性強(qiáng),不易析出晶體,因此更便于保存,可以有效延長(zhǎng)試劑的使用周期。比較了分別以十一鎢硅酸鉀和十一鎢硅酸鈉為凈化試劑,采用本方法在30 mg/L水平進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)(95%置信區(qū)間,自由度為2),得到23種芳香胺的t值均小于t0·05,2(t0·05, 2=4·30),表明鈉鹽和鉀鹽的凈化效果無顯著性差異。
比較了以新配制的Na鹽和1個(gè)月前配制的Na鹽為凈化試劑,本方法在30 mg/L水平進(jìn)行3次加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),經(jīng)t檢驗(yàn)(95%置信區(qū)間,自由度為2), 23種芳香胺的t值均小于t0·05,2(t0·05, 2=4·30),表明二者無顯著性差異。此外,還對(duì)1個(gè)月內(nèi)3個(gè)不同時(shí)間配制的鈉鹽樣品進(jìn)行了紫外光譜分析,結(jié)果表明三者的特征吸收一致,十一鎢硅酸鈉穩(wěn)定無變化,有效期為30d。
2·3 回收率與精密度實(shí)驗(yàn)
以pH 6·0的檸檬酸鹽緩沖溶液模擬人體的汗液環(huán)境,分別加入7·5、15、30mg/L 3個(gè)水平的芳香胺標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn),每一水平分別做6個(gè)平行樣品,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和平均回收率數(shù)據(jù)見表1。
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