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隨著染料化學(xué)工業(yè)的迅猛發(fā)展,紡織、皮革、食品、日用化工等行業(yè)越來越多地應(yīng)用合成染料于生產(chǎn)中.我國的染料年產(chǎn)量達到15萬t[1],其中10%~15%會隨著廢水排入環(huán)境中[2].由于染料含有復(fù)雜的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)、品種繁多、化學(xué)穩(wěn)定性高、生物可降解性低,且多數(shù)染料及其代謝中間產(chǎn)物具有致突變性、致癌性和其他毒性.染料廢水對環(huán)境的污染已是廣大環(huán)?？茖W(xué)工作者重點關(guān)注的問題之一.由于微生物具有繁殖速度快、適應(yīng)性強等特點,利用高效脫色微生物進行環(huán)境污染整治不僅成本低,且可減少二次污染的產(chǎn)生,因此,采用生物法對染料污染進行治理越來越受到人們的關(guān)注[3-5].目前已證實多種偶氮、蒽醌等結(jié)構(gòu)類型的染料均可被微生物降解,分離到的微生物主要包括細菌、真菌等.但對染料的微生物降解研究主要集中于偶氮染料[6-9],對于三苯甲烷類染料的研究報道較少.本文用三苯甲烷類染料堿性孔雀綠為試驗材料,以細菌對其脫色率為檢測指標(biāo),從福建石獅錦尚和伍堡污水處理廠不同的曝氣池活性污泥中分離篩選對堿性孔雀綠染料脫色能力強的高效菌株,并對分離到的株菌進行鑒定,為印染廢水的處理提供參考.
1·材料與方法
1.1材料
1.1.1分離樣品
采自福建石獅錦尚和伍堡污水處理廠不同曝氣池的活性污泥.1.1.2染料
采用三苯甲烷類的染料堿性孔
1.1.3培養(yǎng)基
富集培養(yǎng)基:KH2PO41.8 g,Na2HPO4·12H2O 3.5 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,FeCl3·6H2O 0.01g,蛋白胨2.0 g,牛肉膏3.0 g,葡萄糖5.0 g,染料0.05 g,蒸餾水1 000 mL,pH7.0,121℃滅菌20 min.
生長培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,NaCl 5 g,瓊脂15~20 g,蒸餾水1 000 mL,pH7.0~7.2,121℃滅菌20 min.
染料培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,NaCl 5 g,染料50 mg/L,蒸餾水1 000 mL,pH7.0~7.2,121℃滅菌20 min.
脫色培養(yǎng)基:麥芽糖3%,染料50 mg/L,硝酸銨1%.
染料固體培養(yǎng)基:染料培養(yǎng)基,瓊脂20 g,pH 7.0~7.2,121℃滅菌20 min.
1.1.4儀器
SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠),光學(xué)顯微鏡PM-10AD(Olympus),恒溫搖床HQ45(武漢科學(xué)儀器廠),滅菌消毒器CRDX-280型(上海電安醫(yī)療器械廠),分光光度計723(上海精密科學(xué)儀器有限公司),電子天平(上海精科天平廠),臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠),CS-15R冷凍高速離心機(Beckman),pHS-3C精密酸度計(上海雷磁儀器廠),SW-GF-1F潔凈工作臺(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠).
1.2方法
1.2.1富集及分離
從污水中取出5 mL的樣品,接入含50 mL富集培養(yǎng)基三角瓶中,30℃靜置培養(yǎng)24 h,取出染料顏色有變化的三角瓶,取脫色菌液,經(jīng)適當(dāng)稀釋涂布于含染料的固體分離培養(yǎng)基平板上,30℃恒溫培養(yǎng)3~5 d,根據(jù)菌落形成的脫色圈,挑選出具有脫色能力的菌株,接種于含50 mg/L染料培養(yǎng)基培養(yǎng)3
1.2.2純化
將分離挑取的單菌落在平板上劃線、純化,并鏡檢純度.經(jīng)過多次挑單培養(yǎng)后得到純培養(yǎng).
1.2.3脫色能力的測定
用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基搖床振蕩培養(yǎng)菌體到一定的濃度進行純種擴大培養(yǎng),取1 mL培養(yǎng)好的菌液,加到含20 mL脫色培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶中,30℃靜置培養(yǎng),24 h后取樣,3 500 r/min離心30min,在617 nm處測定上清液的吸光度值,并以不加菌的脫色培養(yǎng)基為對照,計算脫色率,以脫色率的大小來表示染料的脫色能力.
式中,A為不加菌液的吸光度值,B為接菌培養(yǎng)一定時間后上清液的吸光度值,選擇脫色效果好的菌株進行鑒定.
1.2.4菌株鑒定
參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[10]和《一般細菌常用鑒定方法》[11]對分離純化后的菌株進行形態(tài)特征、生理生化特征、菌體染色等鑒定.
B2菌株和B6菌株進一步采用美國BD phoenixTM全自動細菌鑒定/藥敏系統(tǒng)自動鑒定,由福建省疾病控制中心完成.
2·結(jié)果與討論
2.1篩選結(jié)果
經(jīng)過篩選,得到了7株對三苯甲烷染料堿性孔雀綠有比較好的脫色效果的細菌(見表1),7株菌株分別編號為B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7.
由表1可知,不同的菌株對染料脫色效果不同,B2菌株脫色效果最好,脫色率高達99.19%.
2.2初步鑒定
2.2.1菌體染色結(jié)果
不同菌株染色結(jié)果如表2所示.
2.2.2培養(yǎng)特征
菌株在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線,于28℃培養(yǎng)18~24 h,觀察菌落的形態(tài)、大小和生長情況.B1菌株:菌落為淡黃色,菌落偏小,直徑為3~4 mm,邊緣圓整,規(guī)則,放射狀,臍狀.
B2菌株:菌落為白色,菌落較大,直徑為7~8 mm,有同心圓,邊緣圓整,表面光滑濕潤,有光澤,扁平,有莢膜特征.
B3菌株:菌落為白色,菌落中等,直徑為5~6 mm,邊緣圓整,表面光滑濕潤,有光澤,草帽狀.<
B5菌株:菌落為淡黃色,菌落較小,直徑為2~3 mm,邊緣圓整,表面光滑濕潤,有光澤,草帽狀.
B6菌株:菌落為白色,菌落中等,直徑為4~5 mm,邊緣圓整,表面光滑濕潤,有光澤,低凸起.B7菌株:菌落為淡黃色,菌落中等,直徑為5~6 mm,邊緣圓整,規(guī)則,放射狀,扁平.
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