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    以280 nm波長光激發(fā)時，蛋白質(zhì)溶液具有內(nèi)源熒光，因此可以檢測反應(yīng)混合物熒光發(fā)射峰的變化. 未反應(yīng)的絲素蛋白具有350 nm熒光發(fā)射峰，表明主要來自絲素蛋白的酪氨酸殘基，且處于相對親水環(huán)境中. 35 ℃條件下放置不同時間，絲素蛋白溶液熒光發(fā)射峰的位置仍在350 nm處，峰強度僅有10%的減少. 與京尼平反應(yīng)時，絲素蛋白的熒光強度明顯降低，并隨反應(yīng)時間延長而逐漸降低，并且熒光峰的位置由350 nm藍移到325 nm處(圖4)，說明絲素蛋白與京尼平的反應(yīng)劇烈，明顯改變了絲素蛋白的結(jié)構(gòu)和溶液中的構(gòu)象，導(dǎo)致酪氨酸殘基微環(huán)境的改變.

2.4 酸堿度對京尼平與絲素蛋白反應(yīng)的影響
    進一步在80 ℃條件下反應(yīng)2 h，測定生成物特征光吸收值，考察酸堿度對絲素蛋白與京尼平反應(yīng)的影響. 表1結(jié)果顯示，溶液最大吸收峰的位置和峰的強度與溶液酸堿度密切相關(guān). pH 8.0、10.0、11.0時終溶液呈現(xiàn)為藍紫色和淺紫色，具有較大的A590 nm值，表明反應(yīng)完全. pH 5.0和pH 7.0條件下，反應(yīng)終溶液的最大吸收峰在594 nm和595 nm處，A590 nm值較小，分別為0.3和1.4，表明反應(yīng)沒有進行完全. 過酸(pH 3.0)或過堿(pH 12.0)條件下，溶液仍為無色，沒有顏色變化.

2.5 反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定性分析
    一般帶色的物質(zhì)對光有敏感性，容易受光照的影響，反應(yīng)生成物容易發(fā)生光降解. 染色后的蠶絲于強光下暴曬1 wk，顏色沒有發(fā)生任何改變，再于水中浸泡2 d后，也沒有發(fā)生退色現(xiàn)象，說明京尼平與蠶絲反應(yīng)所生成帶顏色的產(chǎn)物具有良好的穩(wěn)定性.
    進一步考察溶液狀態(tài)下京尼平與絲素蛋白反應(yīng)生成的顏色產(chǎn)物的穩(wěn)定性. 在室溫條件下密閉放置1 mo后，染色的絲素蛋白溶液顏色幾乎沒有發(fā)生變化，A/A0為97.3%，說明京尼平與絲素蛋白反應(yīng)產(chǎn)物是穩(wěn)定的. 自然光(實驗測定為650 lx) 照射下，短時間條件下反應(yīng)產(chǎn)物不發(fā)生變化，而5 000 lx光強照射6 h后，最大吸收值有5%的減少(圖5). 以上研究結(jié)果表明，京尼平與絲素蛋白溶液反應(yīng)的顏色產(chǎn)物具有光照穩(wěn)定性.

3 討 論
    京尼平是一種環(huán)烯醚萜化合物，含有—COOH、—OH等多個活性基團，能夠與含氮化合物發(fā)生反應(yīng)[17]. 我們在研究中發(fā)現(xiàn)京尼平能使蠶絲染上一定的顏色. 利用絲素蛋白與京尼平在溶液狀態(tài)下反應(yīng)，紫外可見光光譜分析顯示反應(yīng)產(chǎn)物在590 nm附近處具有最大特征吸收峰，這與京尼平同氨基酸反應(yīng)生成的梔子藍色素的最大吸收峰相似[16]. 絲素蛋白與京尼平反應(yīng)前后的熒光發(fā)射光譜分析表明，京尼平與絲素蛋白是通過與蛋白質(zhì)肽鏈中某些氨基酸側(cè)鏈發(fā)生了反應(yīng)，至于是哪些氨基酸，以及如何進行反應(yīng)，還有待進一步研究.
    實驗結(jié)果顯示，酸堿度(pH值)對京尼平與絲素蛋白間的反應(yīng)具有很大的影響. 已有的研究證明，在弱堿性條件下，溶液中的OH-可作為一個親核基團，首先攻擊京尼平C3原子，形成活性的醛基后，然后才能與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)[18]，因此溶液OH-濃度的高低可能決定了反應(yīng)產(chǎn)物的生成速度和反應(yīng)進行的程度，同時也決定了產(chǎn)物的最終顏色，因此反應(yīng)體系pH值是一個關(guān)鍵因素.
一般染料多通過本身顏色的覆蓋進行染色，也可以通過反應(yīng)而生成有色物質(zhì). 常見的蛋白質(zhì)染色試劑，與蛋白質(zhì)的結(jié)合力較弱，主要靠分子間的作用力，因此，很容易褪色. 而蛋白質(zhì)纖維更難染色. 京尼平通過與蛋白質(zhì)的交聯(lián)反應(yīng)形成最終的顏色產(chǎn)物，因此具有較好的穩(wěn)定性. 京尼平是天然的梔子提取物京尼平苷的水解產(chǎn)物，與絲素蛋白反應(yīng)具有產(chǎn)物顏色穩(wěn)定、細胞毒性小、環(huán)境污染少等優(yōu)點，可以考慮用于蠶絲的直接染色.