摘要：PCR技術(shù)是一種體外擴(kuò)增特定DNA序列的方法。該技術(shù)以其高特異性和靈敏度等優(yōu)點(diǎn)已廣泛用于各領(lǐng)域。本文主要對(duì)PCR技術(shù)的原理及其在一次性使用衛(wèi)生用品微生物檢測(cè)的應(yīng)用前景等方面進(jìn)行綜述。
隨著科學(xué)研究的進(jìn)步，各種新技術(shù)不斷形成且廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。人們對(duì)一些生物指標(biāo)的檢測(cè)手段也進(jìn)入到了一個(gè)新階段，分析研究對(duì)象更多的是選擇了DNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)。PCR（Polymerase Chain Reaction）技術(shù)以其高特異性和靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、水產(chǎn)養(yǎng)殖、環(huán)境監(jiān)測(cè)及其他與DNA鑒定相關(guān)的領(lǐng)域。本文主要對(duì)PCR技術(shù)的原理及其在一次性使用衛(wèi)生用品微生物檢測(cè)的應(yīng)用前景等方面進(jìn)行綜述
1 PCR技術(shù)原理
PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種體外擴(kuò)增DNA序列的技術(shù)?，F(xiàn)代PCR概念最早是由美國(guó)科學(xué)家Kary Mullis于20世紀(jì)80年代早期發(fā)明的，他也因此榮獲了1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。如今該技術(shù)已成為生物前沿技術(shù)之一。
PCR技術(shù)的基本原理類(lèi)似于細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)PCR包括變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)階段。其基本過(guò)程為：①檢測(cè)樣品經(jīng)預(yù)處理后獲得DNA模板模板；②DNA模板的變性：模板DNA經(jīng)加熱至95℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離后成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為其后階段反應(yīng)作準(zhǔn)備；③模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，這時(shí)人工合成的引物與模板DNA單鏈經(jīng)互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；④引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在耐熱DNA聚合酶的催化作用下，以四種三磷酸脫氧核苷酸為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原則，合成一條新的與模板DNA 結(jié)構(gòu)組成相同的新鏈。重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的新鏈，而且這種新鏈又可成為
2 PCR技術(shù)在微生物檢測(cè)的應(yīng)用前景
依據(jù)一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：GB 15979—2002）中的微生物指標(biāo)規(guī)定，在一次性使用衛(wèi)生用品中是不能有大腸桿菌以及三種致病性化膿菌（綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌）的檢出。該要求是對(duì)四種菌的定性檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)中用到的檢測(cè)方法是傳統(tǒng)的微生物鑒定法，先通過(guò)增菌或分離培養(yǎng)，然后進(jìn)一步根據(jù)各菌群特征做一些鑒定試驗(yàn)，最后綜合各項(xiàng)結(jié)果判斷。通常這種傳統(tǒng)的檢測(cè)方法時(shí)間較長(zhǎng)，而且在菌量少的情況下易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。而在環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品檢測(cè)等領(lǐng)域中已經(jīng)應(yīng)用的PCR技術(shù)則可縮短檢測(cè)所消耗的時(shí)間，且敏感性更高。
2.1 大腸桿菌的檢測(cè)
相關(guān)研究顯示，通過(guò)大腸桿菌特異性引物（上游引物：5’-tgt tca gtg gca aga gtt-3’ ，下游引物：5’-taa tcg ata tac ccg ctc-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增可以檢出飲用水中的大腸桿菌，即使在菌量極低的情況下也可以檢出[5]。但該研究還發(fā)現(xiàn)對(duì)于不能夠破壞微生物DNA的消毒方法會(huì)造成PCR檢測(cè)的假陽(yáng)性，而GB 15979—2002中對(duì)一次性使用衛(wèi)生用品所使用到的消毒方法通常為環(huán)氧乙烷消毒、電離輻射消毒和壓力蒸汽消毒。而這幾種滅菌方法都會(huì)直接破壞微生物的核酸，因此PCR技術(shù)用于檢測(cè)一次性使用衛(wèi)生用品中致病菌有可行性。
2.2 綠膿桿菌的檢測(cè)
相關(guān)研究表明使用綠膿桿菌外毒素A（ETA）基因作為模板來(lái)快速檢測(cè)綠膿桿菌。ETA基因僅在綠膿桿菌基因組中存在，且Gray[6]等人已經(jīng)從一個(gè)過(guò)量表達(dá)ETA的綠膿桿菌菌株中克隆和測(cè)定了ETA的結(jié)構(gòu)基因。因此ETA基因可以作為檢出綠膿桿菌的靶基因。根
2.3 金黃色葡萄桿菌和溶血性鏈球菌的檢測(cè)
PCR技術(shù)用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的研究多數(shù)是關(guān)于食品衛(wèi)生。張亞蘭[8]的研究將PCR的反應(yīng)做了優(yōu)化，消除了一些會(huì)影響PCR反應(yīng)的抑制因素，從而提高檢測(cè)方法的靈敏度。同時(shí)應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)鏈球菌的研究數(shù)據(jù)顯示這種方法具有可行性[9-10]。
3 PCR技術(shù)在應(yīng)用過(guò)程中可能存在的問(wèn)題
PCR技術(shù)具有較強(qiáng)的靈敏度、準(zhǔn)確度和特異性。此外，與傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)法相比PCR技術(shù)能縮短檢測(cè)時(shí)間，但同時(shí)將該技術(shù)引進(jìn)到衛(wèi)生用品的檢測(cè)也存在一些問(wèn)題。首先，由于檢測(cè)樣品是衛(wèi)生用品，在樣品的預(yù)處理、樣品DNA的提取等具體的操作過(guò)程中可能會(huì)遇到不同的問(wèn)題；其次，盡管PCR反應(yīng)的步驟很簡(jiǎn)單，但是具體的操作是復(fù)雜的，如退火溫度的確定、延伸時(shí)間的長(zhǎng)短以及循環(huán)數(shù)等。因此不同的反應(yīng)體系應(yīng)該確定適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件以避免假陰性或假陽(yáng)性等情況的產(chǎn)生。所以要引入PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)衛(wèi)生用品中的微生物，需要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，完善檢測(cè)方法。
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